參考周期：常規(guī)試驗7-15工作日,，加急試驗5個工作日,。

注意：因業(yè)務調整,暫不接受個人委托測試,望諒解(高校,、研究所等性質的個人除外)。

細胞劃痕實驗步驟

　　1,、劃線：先用 marker 筆在 6 孔板背后,，用直尺比著，均勻的劃橫線,，大約每隔 0.5～1cm 一道,，橫穿過孔，每孔至少穿過 5 條線;

　　2,、鋪板：處于對數生長期的細胞,，胰蛋白酶消化成單細胞懸液，接種于 6 孔培養(yǎng)板;細胞鋪板 6w/孔,，接種原則為過夜后融合率達到 100%,，每孔最終的培養(yǎng)基總量 2mL;

　　3、細胞培養(yǎng) 37℃,、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h;

　　4,、劃痕：第二天用 200 微升槍頭比著 6 孔板蓋子或直尺，平行或垂直于背后的橫線劃痕,，槍頭要垂直,，不能傾斜;

　　5、清洗：PBS 沖洗細胞 3 次,，除去劃下的細胞,，加入無血清培養(yǎng)基;

　　6、拍照：擦去 6 孔板背后的 marker 橫線劃痕,。4 倍鏡下進行拍照,，保證劃痕居中且垂直，注意背景一致,，加入待測樣本,，設置濃度梯度，可按 0,6,12,24h 時間點取樣,，拍照,。

　　7、結果分析,，使用 ImageJ 軟件打開圖片后,，隨機劃取 6 至 8 條水平線，計算細胞間距離的均值或者劃痕面積均值,。

　　8,、數據處理：

　　細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始劃痕面積-t 時刻劃痕面積)/初始劃痕面積細胞遷移率(傷口愈合率)=(初始細胞間距離均值-t 時刻細胞間距離均值)/初始細胞間距離均值

細胞劃痕實驗注意事項

　　1、劃線的目的只是為了輔助劃痕時劃的更直，有利于后續(xù)拍照分析,，劃線會在拍照前擦去,。

　　2、細胞接種數量需根據細胞生長速度和狀態(tài)而定,，接種原則為過夜后融合率達到 100%,，即細胞間沒有空隙，否則會影響后續(xù)拍照分析,。

　　3,、同濃度不同孔之間劃痕最好使用同一只槍頭，減少劃痕距離的誤差,。劃痕時槍頭垂直,，不能傾斜，可比著直尺或孔板蓋,，保持力度一致，一次性劃完,。

　　4,、沖洗時要溫柔，貼壁加入,，避免沖掉單層細胞,，反復多次沖洗，盡量洗掉所有的細胞碎片,。

　　5,、降低細胞增殖對遷移造成的假陽性結果的方法：①使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細胞增殖對實驗結果的影響;②一般認為 24h 為細胞的一個周期，在選取合適的時間點(6,12,24h)檢測劃痕寬度時,，最好不要超過細胞一個周期的時間;③如果要單純考慮細胞遷移,，可以先用絲裂霉素(1μg/ml)處理 1h，抑制細胞的分裂,。

　　6,、盡量保證各個劃痕寬度一致，人工槍頭制造劃痕難以保證劃痕寬度的一致性,，影響實驗結果,，這也是該方法最大的缺陷，有條件的同學可以選擇 culture Insert(如下圖),，將細胞接種于 Dish 中間的 Insert,，培養(yǎng)。細胞長滿 Insert 區(qū)域后用鑷子移除 Insert 即可產生 500um,、1000um 寬度的劃痕,。

　　7、不是所有的細胞都適合劃痕實驗,，一些細胞呈團簇狀生長,，懸浮細胞更不能進行劃痕實驗,。

　　工程師會根據不同產品類型的特點、不同行業(yè)和不同國家的法規(guī)標準以及客戶的需求,，選取相應的檢測項目和方法進行細胞劃痕實驗,。

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